“液体活检”（liquid biopsy）在肿瘤的早期诊断、用药监控、预后判断等方向的重要性从学术、临床到产业界之间达成越来越明确的共识。按照检测样品分类，液态活检主要有2大方向：游离循环DNA（circulatingcell-free DNA, cfDNA）和循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）。

cfDNA其实就是血液中游离的DNA片段。有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人，作为一个初筛的手段能起到较好的提示作用。

CTC是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。目前FDA认证的CTC应用，主要是通过CTC计数来辅助评估转移性乳腺癌、转移性前列腺癌和转移性结直肠癌的疾病进展。

上述检测对象，可分为两种检测平台：深度测序和数字PCR。相比于目前主流的NGS，数字PCR在如下方面优势突出：操作快速、简便（测序前无需对来源于CTC的DNA进行预扩增）；检测灵敏度高等。

下面我们以莱斯特大学、伦敦帝国学院（ImperialCollege）较近发表在Clinical Cancer Reasearch上的研究成果为文本，梳理NGS和CTC联合检测技术在CTC高检出转移性乳腺癌患者中的具体应用和初步结果。

Mutationanalysis of cell-free DNA and single circulating tumor cells inmetastatic breast cancer patients with high CTC counts.

Clin Cancer Res. 2016Jun 22.

研究方法

这项研究纳入的112位转移性乳腺癌患者，通过Cellsearch平台在7.5ml血液中获得CTC。其中5名患者7.5ml血液中的CTCs超过100个，采用50个肿瘤基因中的2200个COSMIC突变热点的NGS直接与对应的cfDNA及肿瘤原发病灶的组织样本进行比对，无需经过全基因组的预扩增处理。测序在316芯片上完成，文库构建核酸起始量分别为8ng cfDNA和10ng肿瘤原发病灶组织DNA或CTCDNA。同时对病人血清进行CA15-3（肿瘤相关抗原）和ALP（碱性磷酸酶）生化分析。

研究结果

在112位患者中CTC检出率为46%（51/112）,平均检出5个CTCs（分布在1-701个）。HER2+检出率为19%，HER2-检出率为65%；CA15-3阳性（>30U/ml）检出率为64%（72/112），CA15-3阴性（<30U/ml）检出率为36%（40/112）；ALP阳性（>100U/ml）检出率为36%（40/112），ALP阴性（<100U/ml）检出率为64%（72/112）；CTCs和生化指标呈现正相关，CA15-3（P =0.0010）；ALP（P =0.0168）。

CTCs检出数量超过100个的5名转移性乳腺癌患者的CTC cfDNA的NGS结果中发现p.D538G(3.9%), p.H1047R(31%), 和p.E380Q(23.8%)突变。其中具有p.E380Q突变的病人同时为PIK3CA和TP53突变。cfDNA ddPCR结果：对ESR1 p.D538G位点进行确认，除NGS发现的3例病人外，还发现了6例（突变率都在1%以下），总共9例，使检出率提高到18.75%。

CTCs和总cfDNA含量高度相关（P =0.000384）；CTCs和生化指标也呈现正相关，CA15-3（P =0.0010）；ALP（P =0.0168）。但本研究未发现CTCs和具体位点的突变率呈现相关性。

讨论

相较于将CTC来源的DNA作为测序对象进行深度测序，ddPCR对cfDNA来源的突变直接进行检测具有更高的灵敏度。

CTC数值和cfDNA中有无突变（P=0.0026）及cfDNA总含量具有相关性，但和具体位点的突变率无相关性。

作为液态活检的2大来源，细胞层面的CTC还是分子层面的cfDNA哪个在临床上更具有应用价值还需要深入讨论。也许随着研究的深入、临床测试的进一步展开，CTC和cfDNA具有各自不同的应用价值。但本研究已经明确揭示了“液态活检”这个概念在肿瘤预防、治疗等方面的重要性。